Производителност на четири анализи за усилване на нуклеиновата киселина за идентифициране на SARS-COV-2 в Етиопия в Етиопия

Благодаря ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузъра с ограничена поддръжка на CSS. За най -добър опит препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или режим на съвместимост на деактивиране в Internet Explorer). Освен това, за да гарантираме постоянна поддръжка, ние показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва въртележка от три слайда наведнъж. Използвайте предишните и следващите бутони, за да се движите през три слайда наведнъж или използвайте плъзгачите в края, за да се движите през три слайда наведнъж.
След избухването на коронавирусната болест през 2019 г. (Covid-19) в целия свят са разработени много тестове за усилване на търговската нуклеинова киселина (NAATS) и са се превърнали в стандартни анализи. Въпреки че няколко теста са бързо разработени и приложени към лабораторни диагностични тестове, ефективността на тези тестове не е оценена в различни настройки. Следователно, това проучване има за цел да оцени ефективността на Abbott SARS-COV-2, DAAN Gene, BGI и SANSURE BIOTECH анализи, използвайки композитния референтен стандарт (CRS). Проучването е проведено в Етиопския институт за обществено здраве (EPHI) от 1 до 30 декември 2020 г. 164 проби от назофарингеални проби са извлечени с помощта на Mini Kit Qiaamp RNA и системата за приготвяне на ДНК проби Abbott. От 164 екземпляра 59,1% са положителни, а 40,9% са отрицателни за CRS. Положителността на биотехнологията Sansure е значително ниска в сравнение с CRS (P <0,05). Положителността на биотехнологията Sansure е значително ниска в сравнение с CRS (P <0,05). Poloжiteljenые rereзulpportы sansure biotech bыli зnaчitelно -niже по -рьовненик с crs (p <0,05). Положителните резултати на Sansure Biotech са значително по -ниски в сравнение с CRS (P <0,05).与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05 ）。与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05 ）。 Us sansure biotech bыlo зnaчitellagnos mmenñше proжitельных reзulppato l oSraveriю с crs (p <0,05). Sansure Biotech има значително по -малко положителни резултати в сравнение с CRS (P <0,05).Общото съгласие на четирите анализа е 96,3–100% в сравнение с CRS. В допълнение към ниската скорост на позитивност на теста на биотехнологията Sansure, ефективността на четирите анализа беше почти сравнима. Като такъв, анализът на биотехнологиите SANSURE [само за изследвания (RUO)] изисква допълнително валидиране за използването му в Етиопия. И накрая, трябва да се вземат предвид допълнителни изследвания за оценка на анализите с подходящи претенции на производителя.
Лабораторните тестове са част от стратегическия план за Световната здравна организация (СЗО) за коронавирусна болест 2019 (Covid-19) подготвеност и отговор (SPP). Кой съветва, че страните трябва да изграждат лабораторна способност за подобряване на готовността, правилното управление на случаите, бдителността и бързата реакция на предизвикателствата на общественото здраве. Това предполага, че ролята на лабораторията е ключова за характеризиране на болестта и епидемиологията на възникващите инфекциозни агенти и контролиране на тяхното разпространение.
Диагнозата на Covid-19 изисква епидемиологична и медицинска информация, лични симптоми/признаци и рентгенографски и лабораторни данни2. Тъй като в Wuhan е съобщено, че огнището на Covid-19 е отчетено, по целия свят са разработени много търговски тестове за усилване на нуклеиновата киселина (NAATS). Полимеразната верижна реакция на обратната транскрипция в реално време (RRT-PCR) е използвана като рутинен и стандартен метод за лабораторна диагностика на тежък остър респираторен синдром 2 (SARS-COV-2) 3 инфекция. Молекулярното откриване на SARS-COV-2 обикновено се основава на N (ген на нуклеокапсидния протеин), Е (гена на протеина на обвивката) и RDRP (RNA-зависима ген на РНК полимераза) в ORF1A/B (отворена рамка за четене 1A/B). Ген) регион, идентифициран от вирусния геном. Те се считат за основните запазени региони, открити във вирусни геноми за разпознаване на вируси4. Сред тези гени, RDRP и E гените имат висока аналитична чувствителност към откриване, докато N генът има ниска аналитична чувствителност5.
Производителността на PCR анализите може да варира в зависимост от различни фактори като: реактивни реагенти, реактиви за амплификация/откриване, метод на извличане, качество на PCR машината и други инструменти. Към април 2020 г. повече от 48 различни диагностични устройства от девет страни са получили разрешение за спешна употреба (EUA) за диагностика на Covid-196. В Етиопия повече от 14 PCR платформи в реално време се използват за PCR откриване на SARS-COV-2 в 26 институции за обществено здраве, включително ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 и Quant-Studio7. В допълнение, са налични различни PCR тестови комплекти, като тест на Daan Gene, Abbott SARS-COV-2 тест, тест за биотехнологии SARSURE и SARS-COV-2 BGI тест. Въпреки че RRT-PCR е силно чувствителен, някои пациенти с Covid-19 съобщават за фалшиви отрицателни резултати поради недостатъчни копия на вирусна рибонуклеинова киселина (РНК) в проби поради неправилно събиране, транспорт, съхранение и обработка и лабораторни изследвания. Условия и действия на персонала8. В допълнение, настройката на пробата или контрола на неправомерното управление, настройката на прага на цикъла (CT) и кръстосаната реактивност с други патогенни нуклеинови киселини или неактивни/остатъчни SARS-COV-2 РНК могат да доведат до фалшиви положителни резултати при RRT-PCR9 анализи. По този начин е ясно, че PCR тестовете наистина могат да идентифицират носители на генни фрагменти, тъй като те дори не могат да разграничат наистина активни вирусни гени, така че тестовете могат да идентифицират само носители, а не пациенти10. Ето защо е важно да се оцени диагностичната ефективност, като се използват стандартни методи в нашата настройка. Въпреки че много реагенти на NAAT са достъпни в Етиопския институт за обществено здраве (EPHI) и в цялата страна, все още не се съобщава за сравнителна оценка на тяхната ефективност. Следователно, това проучване има за цел да оцени сравнителните характеристики на наличните в търговската мрежа комплекти за откриване на SARS-COV-2 от RRT-PCR, използвайки клинични образци.
В това проучване бяха включени общо 164 участници със заподозрян Covid-19. По-голямата част от пробите са от центрове за лечение (118/164 = 72%), докато останалите 46 (28%) участници са били от центрове за лечение. Сред участниците, които не са лекувани в центъра, 15 (9,1%) са имали клинично заподозрени случаи, а 31 (18,9%) са имали контакти на потвърдени случаи. Деветдесет и три (56,7%) участници са мъже, а средната (± SD) възраст на участниците е 31,10 (± 11,82) години.
В това проучване са определени положителни и отрицателни проценти на четири теста за Covid-19. По този начин, положителните проценти на анализа на Abbott SARS-COV-2, Daan Gene 2019-NCOV анализ, BGI анализ на SARS-COV-2 и анализ на Biotech 2019-NCOV съответно са съответно 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5%. Положителните и отрицателните композитни референтни стандарти (CRS) са съответно 97 (59,1%) и 67 (40,9%) (Таблица 1). В това проучване дефиницията на CRS се основава на правилото „всяко положително“, при което от четири резултата от теста, два или повече резултати от теста, които дават същия резултат, се считат за истински положителни или отрицателни.
В това проучване открихме споразумение за отрицателен процент (NPA) от 100% (95% CI 94,6–100) за всички анализи в сравнение с CRS. Анализът на биотехнологиите SANSURE показа минимален PPA от 93,8% (95% CI 87.2-97.1), а анализът на Daan Gene 2019-NCOV има общо съгласие от 99,4% (95% CI 96.6-99.9). За разлика от тях, общото съгласие между BGI анализ на SARS-COV-2 и анализ на Biotech 2019-NCOV SANSURE е съответно 98,8% и 96,3% (Таблица 2).
Коефициентът на Kappa на Cohen за съгласие между CRS и Abbott SARS-COV-2 резултатите от анализа е напълно последователен (K = 1.00). По подобен начин стойностите на Kappa на Коен, открити от Daan Gene 2019-NCOV, SARS-COV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-NCOV, също са напълно съвместими с CRS (K ≥ 0.925). В този сравнителен анализ, тестът на хи-квадрат (тест на McNemar) показа, че резултатите от анализа на SANSURE BIOTECH 2019-NCOV са значително различни от резултатите от CRS (P = 0,031) (Таблица 2).
Както е показано на фиг.1 Процентът на най-ниската стойност на CT (<20 CT) на Abbott SARS-COV-2 анализ (комбиниран RDRP и N ген) е 87,6%, а ORF1A/B гена CT стойността на сансурната биотехнологична 2019-NCOV анализ показва, че процентът на ниската стойност на CT (<20 ct) е 50,3%, а високата стойност на CT (36–40 ct) е 3,2%. 1 Процентът на най-ниската стойност на CT (<20 CT) на Abbott SARS-COV-2 анализ (комбиниран RDRP и N ген) е 87,6%, а ORF1A/B гена CT стойността на сансурната биотехнологична 2019-NCOV анализ показва, че процентът на ниската стойност на CT (<20 ct) е 50,3%, а високата стойност на CT (36–40 ct) е 3,2%.Както е показано на фиг.1, Прьо сенкина, КТ (<20 КТ) Аналия Абът Сарс-Ков-2 (Комбинир-К-6%, с. ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) Составло 3,2%. 1, the percentage of the lowest Ct value (< 20 Ct) analysis of Abbott SARS-CoV-2 (combined gene RdRp and N) was 87.6%, and the Ct value of ORF1a/b gene analysis of Sansure Biotech 2019-nCoV showed that the percentage of low Ct value (< 20 Ct) accounted for 50.3%, and high value Ct (36–40 Ct) accounted for 3.2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50.3%，高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3.2%。 As shown in Figure 1, the lowest Ct value percentage (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 test (combination of RdRp and N gene) is 87.6%, the ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV test shows low Ct值(< 20 Ct) 的 percentage is 50.3%, 高Ct 值(36–40 Ct) 的 percentage is 3.2%. Как покнано arзmerе 87,6%, a зnaчenie-ct gена orf1a/b lsssledosnii sansure biotech 2019- Anaз ncov покрадил nijkiй ct. Както е показано на фигура 1, анализът на Abbott SARS-COV-2 (комбиниращ RDRP и N гените) има най-ниския процент CT стойност (<20 CT) при 87,6%, докато CT стойността на гена ORF1A/B в изследването на Biotech за сансура 2019-анализът на NCOV показа нисък CT. Proцеnt зnaчеniй (<20 ct) саставил 50,3%, aproцеnt Vыsosokiх зnaчeniй ct (36–40 ct) с вторил 3,2%. Процентът на стойностите (<20 ct) е 50,3%, а процентът на високите стойности на CT (36–40 CT) е 3,2%.Тестът Abbott SARS-COV-2 B записа стойности на CT над 30. От друга страна, на BGI SARS-COV-2 анализ ORF1A/B генът има висока стойност на CT (> 36 CT) е 4% (фиг. 1). От друга страна, на BGI SARS-COV-2 анализ ORF1A/B генът има висока стойност на CT (> 36 CT) е 4% (фиг. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). От друга страна, при анализа на BGI SARS-COV-2 ген ORF1A/B има висока стойност на CT (> 36 CT), процентът от които е 4% (фиг. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-COV-2 检测中 ， ORF1A/B 基因具有高 CT 值（> 36 CT ）的百分比为 4%（图 1 ）。 От друга страна, при откриване на BGI SARS-COV-2 процентът на ORF1A/B ген с висока стойност на CT (> 36 CT) е 4% (Фигура 1). С ДРУГОй СТОРОНы, В- От друга страна, в анализа на BGI SARS-COV-2 процентът на ORF1A/B гени с високи стойности на CT (> 36 CT) е 4% (фиг. 1).
В това проучване взехме 164 проби от назофарингеални проби. За всички видове анализи се извършва изолация и усилване на РНК, използвайки методите и комплектите, препоръчани от съответните производители.
Това проучване показа, че тестът на Abbott за SARS-COV-2 има същите резултати от откриване като CRS, със 100% положителен, отрицателен и цялостен съгласие. Споразумението на Kappa на Cohen е 1,00, което показва пълно съгласие с CRS. Подобно проучване на Университета във Вашингтон в САЩ установи, че общата чувствителност и специфичност на теста на Abbott за SARS-COV-2 е съответно 93% и 100%, в сравнение с определения за лаборатория анализ (LDA) на CDC. 11. Системата за откриване на Abbott SARS-COV-2 се основава на едновременното комбинирано откриване на N и RDRP гените, тъй като и двата гена са по-чувствителни, минимизирайки фалшиви отрицания12. Проучване във Виена, Австрия също показа, че големият обем на пробата за екстракция и обемите за откриване на елуирания свеждат до минимум ефектите на разреждане и повишават ефективността на откриване13. По този начин, перфектното съвпадение на Abbott за анализа на SARS-COV-2 може да бъде свързано със система за откриване на платформа, която едновременно открива комбинаторни гени, извлича голям брой проби (0,5 ml) и използва голямо количество елуент (40 ul).
Нашите резултати също показаха, че ефективността на откриване на генетичния тест на DAAN е почти същата като тази на CRS. Това е в съответствие с проучване14, проведено в университета в Анхуи в Хуейнан, Китай, и претенцията на производителя за 100% положително споразумение. Въпреки съобщенията за последователни резултати, една проба е невярна отрицателна след повторно тестване на същия елуат, но е положителна в Abbott SARS-COV-2 и Sansure Biotech NCOV-2019. Това предполага, че може да има променливост в резултатите при различни видове анализи. Независимо от това, в проучването, проведено в China15, резултатът от DAAN генния анализ е значително различен (P <0,05) в сравнение с техния референтен анализ, дефиниран в LAB. Независимо от това, в проучването, проведено в China15, резултатът от DAAN генния анализ е значително различен (P <0,05) в сравнение с техния референтен анализ, дефиниран в LAB. ТЕМ НЕМЕ, ВИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОВЕДЕННОМ В КИТАЕ15, РЕЛЕТЕТЕТА ОТИЛИчА ДЕАН ДЕН ГЕНА ОИТИЛО ОТИА ladaboratrnogos -эtalonnogoso analiза. Въпреки това, в проучване в China15, резултатът от анализ на Daan Gene е значително различен (P <0,05) от техния лабораторен референтен анализ.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（ p <0,05 ）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однико В -сследований, Проведеном В Китае15, Рельтьтат -Генеети -ешегоугаеста Даан Пуланьно Отатлаута -анально Сравнений с его -атлонхх лобарарн -тим. Въпреки това, в проучване в China15, резултатите от генетичния тест на Daan са значително различни (P <0,05) в сравнение с неговия референтен лабораторен тест.Това несъответствие може да се дължи на чувствителността на референтния тест за откриване на SARS-COV-2 и по-нататъшните проучвания могат да бъдат важни за определяне на причината.
В допълнение, нашето проучване оцени сравнителните резултати на BGI анализ на SARS-COV-2 с CRS, показвайки отлично споразумение с положителен процент (PPA = 97,9%), отрицателен процент споразумение (NPA = 100%) и общото споразумение за процент по пол (OPA). ). = 98,8%). Стойностите на Kappa на Коен показаха добро съгласие (k = 0,975). Проучванията в Холандия16 и China15 показват последователни резултати. Тестът на BGI SARS-COV-2 е тест за откриване на един ген (ORF1A/B), използвайки 10 µL амплификация/откриване на елуат. Въпреки доброто статистическо съгласие с нашите референтни резултати, анализът пропусна две положителни проби (1,22%) от общата извадка. Това може да има огромни клинични последици за динамиката на предаване както на ниво пациент, така и на общността.
Друг сравнителен анализ, включен в това проучване, е анализът на RRT-PCR (RUO) Sansure Biotech NCOV-2019; Общият процент на мача е 96,3%. Силата на споразумението също се определя от стойността на Kappa на Коен, която беше 0,925, което показва пълно съгласие с CRS. Отново нашите резултати са идентични с проучванията, провеждани в Университета Централен Южен в Чанша, Китай, и в отделението за клинична лаборатория на Народната болница в Ливжоу, град Люжоу, Китай17. Въпреки че е регистрирано горното добро статистическо съгласие, тестът за хи-квадрат (тест на MacNemar) показа, че резултатът от теста на биотехнологиите Sansure има статистически значима разлика в сравнение с CRS (P <0,005). Въпреки че е регистрирано горното добро статистическо съгласие, тестът за хи-квадрат (тест на MacNemar) показа, че резултатът от теста на биотехнологиите Sansure има статистически значима разлика в сравнение с CRS (P <0,005). Nesmotryna na tO, чtO bыlo зафирдовано (Критрий Макнамара) Покал, О, рекнат Аналия, сансира Биотех, на Схатий -еееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееееегоо (с. 0,005). Въпреки че е записано доброто статистическо споразумение, тестът за хи-квадрат (тест на McNemar) показа, че резултатът от теста на биотехнологиите Sansure има статистически значима разлика в сравнение с CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验（ Macnemar 检验）表明 ， Sansure Biotech 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异（ P <0,005 ）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 一致性 但 检验 （（ （（ macnemar 检验 表明 ， ， Sansure Biotech 检测 结果 与 Crs 相比 具有 显着 （（ P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Нисмотрина Сстатийески -Инайму -Рахнийу (P <0,005) Менеу -Аналимом Сансуре Биотехнихни и Крс. Въпреки доброто статистическо споразумение, отбелязано по-горе, тестът за хи-квадрат (тест на McNemar) показа статистически значима разлика (p <0,005) между теста на биотехнологията на Sansure и CRS.Установено е, че шест проби (3,66%) са фалшиви отрицателни в сравнение с CRS (допълнителна таблица 1); Това е много важно, особено предвид динамиката на предаване на вируса. Горните данни също поддържат тази ниска скорост на откриване15.
В това проучване стойностите на CT бяха определени за всеки анализ и съответната платформа, като най-ниската средна стойност на CT, отчетена в анализа на Abbott SARS-COV-2. Този резултат може да е свързан с едновременната комбинирана система за генетично тестване на Abbott за откриване на SARS-COV-2. Следователно, според фигура 1, 87,6% от резултатите от Abbott SARS-COV-2 са имали стойности на КТ под 20. Само малък брой резултати от извадката (12,4%) са били в диапазона 20-30. Стойностите на CT над 30 не са записани. В допълнение към използването на Abbott от генетичния формат за тестване на SARS-COV-2, този резултат може да бъде свързан с по-ниската граница на откриване (32,5 РНК копия/mL) 18, което е три пъти по-ниска от долната граница на компанията от 100 РНК копия/мл. ml) 19.
Това проучване има някои ограничения: Първо, ние нямаме стандартни/референтни методи [като вирусно натоварване или други лабораторни тестове (LDA)] поради липса на ресурси. Второ, всички екземпляри, използвани в това проучване, са назофарингеални тампони, докато резултатите не са приложими за други видове екземпляри, а трети, размерът на извадката ни е малък.
Това проучване сравнява ефективността на четири RRT-PCR теста за SARS-COV-2, използвайки назофарингеални проби. Всички анализи за откриване имат почти сравнима ефективност, с изключение на теста на Biotech на Sansure. Освен това, ниската скорост на положителност е идентифицирана в теста на биотехнологиите SANSURE в сравнение с CRS (P <0,05). Освен това, ниската скорост на положителност е идентифицирана в теста на биотехнологиите SANSURE в сравнение с CRS (P <0,05). Кроме того, в Teste sansure biotech bыl Vыvynen ni -inkiй proцеnt proжiteljnых рьоульото по - В допълнение, тестът за биотехнологии SANSURE показва нисък процент от положителни резултати в сравнение с CRS (P <0,05).此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。 Кроме того, аналих сансура биотехнологичен овел -блуеееекюх уровеньол -тильонхн -ср. (P <0,05). В допълнение, анализът на биотехнологиите SANSURE има по -ниска степен на положителност в сравнение с CRS (P <0,05).Анализът на Biotech Biotech NCOV-2019 (RUO) на SANSURE (RUO) на PPA, NPA и общото споразумение надвишава 93,5% с Cohen Kappa сила на стойността на споразумението 0,925. И накрая, анализът на биотехнологиите SANSURE (RUO) се нуждае от допълнително валидиране за използване в Етиопия и трябва да се вземат предвид допълнителни изследвания за оценка на претенциите от отделни производители.
Сравнителният дизайн на проучването е проведен в четири здравни заведения в Аддис Абеба, болница Ека Котебе, Център за лечение на църквата на хилядолетието, Мемориална болница в Зеводиту и специализирана болница за туберкулоза на Сейнт Петър. Данните са събрани между 1 и 31 декември 2020 г. Медицинските заведения за това проучване са целенасочено избрани въз основа на техния голям брой случаи и наличието на основни лечебни центрове в града. По подобен начин инструментите, включително PCR инструментите ABI 7500 и Abbott M2000 в реално време, бяха избрани съгласно препоръките на производителите на реагенти на NAAT и четири комплекта за откриване на PCR бяха избрани за това проучване, тъй като повечето лаборатории в Етиопия са използвали поне поне четири от тях. Генски тест, Abbott SARS-COV-2 тест, тест за биотехнологии SANSURE и BGI тест SARS-COV-2, извършен по време на изследването).
Тестването за SARS-COV-2 се извършва от 1 до 30 декември 2020 г., използвайки 3 ml вирусна транспортна среда (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Китай) от лица, разследвани за Covid-19, насочени към Ephi. Назофарингеалните проби бяха събрани от обучени колекционери на проби и изпращани в Ephi в тройни опаковки. Преди изолацията на нуклеиновата киселина, всяка проба е присвоена уникален идентификационен номер. Екстракцията се извършва от всяка проба веднага след пристигане с помощта на ръчни и автоматични методи за извличане. По този начин, за автоматично извличане на Abbott M2000, 1,3 ml (включително 0,8 ml Dead обем и 0,5 ml извличане на обем на входа) на пробата се извлича от всяка проба и се преминава през системата за приготвяне на пробата на ДНК на Abbott (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, САЩ). ) Партида от 96 [92 проби, две контроли за откриване и две контроли, които не са не-табла (NTC)], бяха включени в цялостния процес (извличане и откриване) на два кръга SARS-COV-2 (EUA) в реално време. минно дело. По същия начин, за ръчно извличане използвайте едни и същи проби (за автоматично извличане и откриване). По този начин, през целия процес, 140 µl проби бяха аликвотирани и екстрахирани с помощта на Qiaamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Германия) в партиди от 24 (включително 20 проби, две контроли за анализ и две NTC) на девет кръга. Ръчно извлечените елуити се амплифицират и се откриват с помощта на термичен циклич ABI 7500, използвайки BGI анализ на SARS-COV-2, DAAN генна анализ и анализ на биотехнологии SARSURE.
Автоматизираната изолация и пречистване на вирусната РНК на SARS-COV-2 следва принципа на магнитните зърна, използвайки реагенти за приготвяне на проби от ДНК Abbott. Инактивирането на проби и разтваряне на вирусни частици се извършва с помощта на детергент, съдържащ гуанидин изотиоцианат, за да се денатурира протеина и инактивира RNase. След това РНК се отделя от протеина чрез отделяне на твърда фаза с помощта на силициев диоксид, т.е. гуанидиниевата сол и алкалното рН на лизисния буфер насърчават свързването на нуклеиновите киселини със силициев диоксид (SiO2). Стъпката за изплакване премахва останалите протеини и отломки, за да се получи ясно разтвор. Прозрачната РНК се изолира от микрочастици на базата на силициев диоксид, използвайки магнитното поле на инструмента 20,21. От друга страна, ръчната изолация и пречистване на РНК се извършва чрез метода на въртящата се колона, използвайки центрофугиране вместо магнитна стойка и отделяне на микрочастици от елуента.
Тестът за откриване на Abbott в реално време SARS-COV-2 (Abbott Molecular, Inc.) беше извършен съгласно инструкциите на производителя, който получи EUA19,22 от СЗО и FDA. В този протокол пробата инактивиране преди екстракция се извършва във водна баня при 56 ° С в продължение на 30 минути. След инактивиране на вируса, екстракцията на нуклеинова киселина се извършва върху инструмент Abbott M2000 SP от 0,5 ml VTM, използвайки система за приготвяне на проби Abbott M2000 DNA. Според производителя. Амплификацията и откриването се извършват с помощта на инструмент Abbott M2000 RT-PCR и се извършва двойно откриване за RDRP и N гените. Rox) и VIC P (собствено багрило) за насочване и откриване на вътрешни контроли, което позволява едновременно откриване на двата продукта за усилване 19.
Методът за откриване на амплификация на този комплект се основава на едноетапната RT-PCR технология. ORF1A/B и N гените са избрани като запазени региони от DAAN генна технология за откриване на амплификация на целевия регион. Специфични праймери и флуоресцентни сонди (N генни сонди, обозначени с FAM, ORF1A/B сонди, обозначени с VIC), са проектирани да откриват SARS-COV-2 РНК в проби. Крайните елуенти и главни смеси се приготвят чрез добавяне на 5 ul елуент към 20 ul от главния смес към краен обем от 25 ul. Амплификацията и откриването се извършват едновременно на PCR инструмент ABI 750024 в реално време.
ORF1A/B и N гените са открити с помощта на SANSURE BIOTECH NCOV-2019 DIAGNOTIC KIT на нуклеинова киселина (флуоресцентно PCR откриване). Подгответе специфични сонди за всеки целеви ген, като изберете FAM канала за ORF1A/B региона и ROX канал за N гена. Към този комплект за анализ се добавят реагенти на Eluent и Master Mix, както следва: Пригответе 30 µl реагент на Master Mix и 20 µl елуирана проба за откриване/амплификация. PCR в реално време PCR ABI 750025 е използван за усилване/откриване.
Тестът SARS-COV-2 BGI е флуоресцентно RRT-PCR комплект в реално време за диагностициране на Covid-19. Целевият регион е разположен в ORF1A/B региона на генома SARS-COV-2, който е единен метод за откриване на ген. В допълнение, човешката домакинска ген β-актин е вътрешно регулиран целеви ген. Главният смес се приготвя чрез смесване на 20 ul от главния смес реагент и 10 ul от екстрахираната РНК проба в кладенец 26. За амплификация и откриване на ABI 7500 флуоресцентни количествен PCR инструмент в реално време. Всички усилване на нуклеиновата киселина, условията на PCR за всеки анализ и интерпретацията на резултатите бяха извършени съгласно съответните инструкции на производителя (Таблица 3).
В този сравнителен анализ не използвахме метода на референтния стандарт за определяне на процентно съгласие (положително, отрицателно и като цяло) и други параметри за сравнение за четирите анализа. Всяко сравнение на теста е направено с CRS, в това проучване CRS е определен от правилото „всеки положителен“ и резултатът е определен, а не от един тест, използвахме поне два съвпадащи резултати от теста. В допълнение, в случай на предаване на Covid-19, фалшивите отрицателни резултати са по-опасни от фалшивите положителни резултати. Следователно, да се каже „положителен“ възможно най -точно от резултат на CRS, най -малко два теста за анализ трябва да са положителни, което означава, че най -малко един положителен резултат вероятно ще идва от анализ на ЕУА. По този начин, от четири резултата от теста, два или повече резултати от теста, които дават един и същ резултат, се считат за истински положителен или отрицателен18,27.
Данните бяха събрани с помощта на структурирани формуляри за извличане на данни, въвеждането и анализът на данните бяха извършени с помощта на статистически софтуер на Excel и SPSS версия 23.0 за описателна статистика. Анализирани са положителни, отрицателни и общи процентни съгласие и се използва оценка на Kappa за определяне на степента на съгласие на всеки метод с CRS. Стойностите на Kappa се интерпретират по следния начин: 0,01 до 0,20 за леко съгласие, 0,21 до 0,40 за общо споразумение, 0,41-0,60 за умерено споразумение, 0,61-0,80 за основно споразумение и 0,81-0,99 за пълно споразумение28.
Етичното разрешение е получено от Университета в Адис Абеба и всички експериментални протоколи за това проучване са одобрени от Съвета за преглед на научната етика на Етиопския институт за обществено здраве. Референтният номер за лиценза EPHI Ethics е EPHI/IRB-279-2020. Всички методи бяха приложени в съответствие с препоръките и разпоредбите на националните национални указания на Етиопия за третиране на Covid-19. Освен това беше получено писмено информирано съгласие от всички участници в проучването преди участието в проучването.
Всички данни, получени или анализирани в това проучване, са включени в тази публикувана статия. Данните в подкрепа на резултатите от това проучване са достъпни от съответния автор при разумна заявка.
Световна здравна организация. Препоръки за стратегии за лабораторни тестове за Covid-19: Временни насоки, 21 март 2020 г. No. WHO/2019-NCOV/LAB_TESTING/2020.1 (СЗО, 2020 г.).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Smart Diagnise в спешното отделение: all-in на практика. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Smart Diagnise в спешното отделение: all-in на практика.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. и Gurgulianis, Ki Intelligent Diagnosis of Covid-19 в спешното отделение: всичко на практика.Muliou DS, Pantazopoulos I. и Gurgulyanis ki интелигентна диагноза на Covid-19 в спешните отделения: интеграция от край до край. Експерт Reavend Respire. лекарство. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Оценка на Covid19 ID сега EUA анализ. Mitchell, SL & St George, K. Оценка на Covid19 ID сега EUA анализ.Mitchell, SL и St. George, K. Оценка на Covid19 ID сега EUA анализ.Mitchell SL и St. George K. Оценка на Covid19 ID сега EUA анализ. J. Clinical. Вирус. 128, 104429. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
СЗО. Лабораторно откриване на коронавирусна болест 2019 (Covid-19) при заподозряно човешко заболяване. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (достъп до 15 август 2020 г.) (СЗО, 2020 г.).
Udugama, B. et al. Диагностика на Covid-19: заболявания и инструменти за тестване. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Създаване на Колежа по патолози от Източна, Централна и Южна Африка - Регионално училище по патология на Близкия изток и Южна Африка. Африка. J. Lab. лекарство. 9 (1), 1-8 (2020).
Етиопски институт за обществено здраве, Федерално министерство на здравеопазването. Временна национална стратегия и насоки за лабораторна диагностика на Covid-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/ephi_pheoc_covid-19_laboratory_diagnosis_eng.pdf (достъп до 12 август 2020 г.) (Ephi, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, като фалшиви отрицателни тестове за предизвикателства и последици за инфекция SARS-COV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, като фалшиви отрицателни тестове за предизвикателства и последици за инфекция SARS-COV-2.Voloshin S., Patel N. и Kesselheim като фалшиво-отрицателни тестове за инфекции на SARS-COV-2 и техните последици.Voloshin S., Patel N. и Kesselheim като фалшиво-отрицателни тестове за провокация и въздействието на инфекцията SARS-COV-2. Н. инж. J. Медицина. 383 (6), E38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI фалшиво-позитивни и фалшиво отрицателни случаи на Covid-19: стратегии за респираторна профилактика и управление, ваксинация и допълнителни перспективи. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI фалшиво-позитивни и фалшиво отрицателни случаи на Covid-19: стратегии за респираторна профилактика и управление, ваксинация и допълнителни перспективи. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегии лечения, Вакхиная и Дхальне -е перолпневы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI False Positive и False отрицателни случаи на Covid-19: Респираторни стратегии за профилактика и лечение, ваксинация и път напред.Muliu, DS и Gurgulianis, KI фалшиво-позитивни и фалшиво-отрицателни случаи на Covid-19: Стратегии за респираторна профилактика и лечение, ваксинация и път напред. Експерт Reavend Respire. лекарство. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 Диагноза в отделението за спешни случаи: Виждане на дървото, но загуба на гората. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 Диагноза в отделението за спешни случаи: Виждане на дървото, но загуба на гората.Mouliou, DS, Ioannis, P. and Konstantinos, G. Covid-19 Диагноза в отделението за спешни случаи: Вижте дървото, загуби гората.Muliou DS, Ioannis P. и Konstantinos G. Covid-19 Диагноза в спешните отделения: Няма достатъчно гора за дърветата. Се появяват. лекарство. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Валидиране и валидиране на аналитичните и клиничните показатели на Abbott в реално време SARS-COV-2. J. Clinical. Вирус. 129, 104474. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на пет грундира от различен геномен регион на Covid-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на пет грундира от различни геномни региони на Covid-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. и Aflatunyan, B. Сравнение на пет групи праймери от различни региони на генома на Covid-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционален RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自 Covid-19 不同基因组区域的五个引物组 ， 用于通过常规 RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на 5 различни генетични региона на Covid-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. и Aflatunyan B. Сравнение на пет групи праймери от различни региони на генома на Covid-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Иран. J. Микробиология. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Предварителни резултати от Националната програма за оценка на качеството за откриване на SARS-COV-2 геномни последователности. J. Clinical. Вирус. 129, 104537. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Аналитична оценка на ефикасността на пет RT-PCR комплекта за тежък остър респираторен синдром коронавирус 2. J. Clinical. Лаборатория. анус. 35 (1), E23643 (2021).
Wang B. et al. Оценка на седем налични в търговската мрежа комплекти SARS-COV-2 РНК за откриване на РНК в Китай въз основа на полимеразна верижна реакция в реално време (PCR). клинични. Химически. Лаборатория. лекарство. 58 (9), E149 - E153 (2020).
Van Casteren, PB et al. Сравнение на седем търговски RT-PCR Covid-19 Диагностични комплекта. J. Clinical. Вирус. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Сравнение на диагностичната ефективност на два PCR комплекта за откриване на нуклеинови киселини SARS-COV-2. J. Clinical. Лаборатория. анус. 34 (10), E23554 (2020).
Lefart, PR и др. Сравнително проучване на четири платформи за тестване на амплификация на нуклеинова киселина SARS-COV-2 (NAAT) показа, че сега работата на ID е значително разградена в зависимост от типа на пациента и пробата. диагноза. Микробиология. Заразейте. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Abbott Molecule. Abbott в реално време SARS-COV-2 Анализ на пакета. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/realtime-sars-cov-2-assay. 1-12. (От 10 август 2020 г.) (2020 г.).
Klein, S. et al. SARS-COV-2 РНК изолация с помощта на магнитни топчета за бързо мащабно откриване чрез RT-QPCR и RT-LAMP. Вирус 12 (8), 863 (2020).