Изпълнение на четири анализа за амплификация на нуклеинова киселина за идентифициране на SARS-CoV-2 в Етиопия

Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва въртележка от три слайда наведнъж. Използвайте бутоните Предишен и Следващ, за да преминете през три слайда наведнъж, или използвайте бутоните на плъзгача в края, за да преминете през три слайда наведнъж.
След избухването на коронавирусната болест (COVID-19) през 2019 г. много комерсиални тестове за усилване на нуклеинова киселина (NAAT) са разработени по целия свят и са се превърнали в стандартни анализи. Въпреки че няколко теста бяха бързо разработени и приложени към лабораторни диагностични тестове, ефективността на тези тестове не беше оценена в различни настройки. Следователно това проучване имаше за цел да оцени ефективността на анализите на Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI и Sansure Biotech, използвайки композитния референтен стандарт (CRS). Проучването е проведено в Етиопския институт за обществено здраве (EPHI) от 1 до 30 декември 2020 г. 164 назофарингеални проби са извлечени с помощта на мини комплекта QIAamp RNA и системата за подготовка на проби на Abbott DNA. От 164 проби 59,1% са положителни и 40,9% са отрицателни за CRS. Положителността на Sansure Biotech е значително ниска в сравнение с CRS (p <0,05). Положителността на Sansure Biotech е значително ниска в сравнение с CRS (p <0,05). Положителните резултати от Sansure Biotech са значително по-ниски в сравнение с CRS (p <0,05). Положителните резултати на Sansure Biotech са значително по-ниски в сравнение с CRS (p <0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p <0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p <0,05). В Sansure Biotech имаше значително по-малко положителни резултати в сравнение с CRS (p <0,05). Sansure Biotech има значително по-малко положителни резултати в сравнение с CRS (p <0,05).Общото съгласие на четирите анализа е 96,3–100% в сравнение с CRS. В допълнение към ниската степен на положителност на анализа Sansure Biotech, ефективността на четирите анализа беше почти сравнима. Като такъв, анализът Sansure Biotech [само за научни изследвания (RUO)] изисква допълнително валидиране за употребата му в Етиопия. И накрая, трябва да се обмислят допълнителни изследвания, за да се оценят анализите с подходящи твърдения на производителя.
Лабораторните тестове са част от Стратегическия план на Световната здравна организация (СЗО) за готовност и реакция (SPRP) за коронавирусна болест 2019 (COVID-19). СЗО съветва страните да изградят лабораторен капацитет за подобряване на готовността, правилното управление на случаите, бдителността и бързата реакция на предизвикателствата за общественото здраве. Това предполага, че ролята на лабораторията е ключова за характеризиране на заболяването и епидемиологията на възникващите инфекциозни агенти и контролиране на тяхното разпространение.
Диагнозата на COVID-19 изисква епидемиологична и медицинска информация, лични симптоми/признаци и радиографски и лабораторни данни2. Откакто е докладвано огнището на COVID-19 в Ухан, Китай, много комерсиални тестове за усилване на нуклеинова киселина (NAAT) са разработени по целия свят. Полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция в реално време (rRT-PCR) се използва като рутинен и стандартен метод за лабораторна диагностика на инфекция с тежък остър респираторен синдром 2 (SARS-CoV-2)3. Молекулярното откриване на SARS-CoV-2 обикновено се основава на гените N (ген на нуклеокапсиден протеин), E (ген на протеин на обвивката) и RdRp (ген на РНК-зависима РНК полимераза) в ORF1a/b (отворена четяща рамка 1a/b) . ген) регион, идентифициран от вирусния геном. Те се считат за основните запазени региони, открити във вирусните геноми за разпознаване на вируси4. Сред тези гени, гените RdRp и E имат висока аналитична чувствителност на откриване, докато N генът има ниска аналитична чувствителност5.
Ефективността на PCR анализите може да варира в зависимост от различни фактори като: екстракционни реагенти, реагенти за амплификация/откриване, метод на екстракция, качество на PCR машината и други инструменти. Към април 2020 г. повече от 48 различни диагностични устройства от девет държави са получили разрешение за спешна употреба (EUA) за диагностика на COVID-196. В Етиопия повече от 14 PCR платформи в реално време се използват за PCR откриване на SARS-CoV-2 в 26 обществени здравни институции, включително ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 и Quant-studio7. Освен това се предлагат различни комплекти за PCR тестове, като Daan Gene тест, Abbott SARS-CoV-2 тест, Sansure Biotech тест и SARS-CoV-2 BGI тест. Въпреки че rRT-PCR е силно чувствителен, някои пациенти с COVID-19 съобщават за фалшиво отрицателни резултати поради недостатъчни копия на вирусна рибонуклеинова киселина (РНК) в пробите поради неправилно събиране, транспортиране, съхранение и манипулиране и лабораторно изследване. условия и действия на персонала8. В допълнение, неправилното боравене с проби или контроли, настройката на прага на цикъла (Ct) и кръстосаната реактивност с други патогенни нуклеинови киселини или неактивна/остатъчна SARS-CoV-2 РНК може да доведе до фалшиво положителни резултати при rRT-PCR9 анализи. По този начин е ясно, че PCR тестовете наистина могат да идентифицират носители на генни фрагменти, тъй като те дори не могат да направят разлика между наистина активни вирусни гени, така че тестовете могат да идентифицират само носители, а не пациенти10. Следователно е важно да се оцени ефективността на диагностиката, като се използват стандартни методи в нашата среда. Въпреки че много NAAT реагенти са налични в Етиопския институт за обществено здраве (EPHI) и в цялата страна, все още не е докладвана сравнителна оценка на тяхната ефективност. Следователно, това проучване имаше за цел да оцени сравнителната ефективност на наличните в търговската мрежа комплекти за откриване на SARS-CoV-2 чрез rRT-PCR с помощта на клинични проби.
Общо 164 участници със съмнение за COVID-19 бяха включени в това проучване. По-голямата част от пробите са от центрове за лечение (118/164 = 72%), докато останалите 46 (28%) участници са от центрове без лечение. Сред участниците, които не са лекувани в центъра, 15 (9,1%) са имали клинично подозирани случаи и 31 (18,9%) са имали контакти с потвърдени случаи. Деветдесет и трима (56,7%) участници бяха мъже, а средната (± SD) възраст на участниците беше 31,10 (± 11,82) години.
В това проучване са определени положителни и отрицателни нива на четири теста за COVID-19. По този начин положителните нива на теста Abbott SARS-CoV-2, теста Daan Gene 2019-nCoV, теста SARS-CoV-2 BGI и анализа Sansure Biotech 2019-nCoV бяха съответно 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5%. . Резултатите от положителния и отрицателния съставен референтен стандарт (CRS) бяха съответно 97 (59,1%) и 67 (40,9%) (Таблица 1). В това проучване дефиницията на CRS се основава на правилото „всеки положителен“, при което от четири резултата от теста, два или повече резултата от теста, които дават един и същ резултат, се считат за наистина положителни или отрицателни.
В това проучване открихме отрицателно процентно съгласие (NPA) от 100% (95% CI 94,6–100) за всички анализи в сравнение с CRS. Анализът на Sansure Biotechnology показа минимален PPA от 93,8% (95% CI 87,2-97,1), а анализът на Daan Gene 2019-nCoV имаше общо съгласие от 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Обратно, общото съгласие между анализа SARS-CoV-2 BGI и анализа Sansure Biotech 2019-nCoV беше съответно 98,8% и 96,3% (Таблица 2).
Капа коефициентът на съответствие на Cohen между CRS и резултатите от анализа на SARS-CoV-2 на Abbott беше напълно съвместим (K = 1,00). По същия начин капа стойностите на Cohen, открити от Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-nCoV, също са напълно съвместими с CRS (K ≥ 0,925). В този сравнителен анализ тестът хи-квадрат (тест на McNemar) показа, че резултатите от анализа на Sansure Biotech 2019-nCoV са значително различни от резултатите от CRS (p = 0,031) (Таблица 2).
Както е показано на фиг.1 процентът на най-ниската стойност на Ct (< 20 Ct) от анализа на Abbott SARS-CoV-2 (комбиниран RdRp и N ген) е 87,6%, а стойността на Ct на гена ORF1a/b от анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показва, че процентът на нисък Стойността на Ct (< 20 Ct) е 50,3% и високата стойност на Ct (36–40 Ct) е 3,2%. 1 процентът на най-ниската стойност на Ct (< 20 Ct) от анализа на Abbott SARS-CoV-2 (комбиниран RdRp и N ген) е 87,6%, а стойността на Ct на гена ORF1a/b от анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показва, че процентът на нисък Стойността на Ct (< 20 Ct) е 50,3% и високата стойност на Ct (36–40 Ct) е 3,2%.Както е показано на фиг.1, процентът на най-малкото значение на Ct (< 20 Ct) анализ на Abbott SARS-CoV-2 (комбиниран ген RdRp и N) възлиза на 87,6%, а значението на Ct на гена ORF1a/b анализ на Sansure Biotech 2019-nCoV показа, че процентът на ниско значение на Ct (< 20 Ct) съставляващ 50,3%, а високо значение Ct (36–40 Ct) съставено 3,2%. 1, процентът на най-ниската Ct стойност (< 20 Ct) анализ на Abbott SARS-CoV-2 (комбиниран ген RdRp и N) е 87,6%, а Ct стойността на ORF1a/b генния анализ на Sansure Biotech 2019-nCoV показа че процентът на ниска стойност на Ct (< 20 Ct) представлява 50,3%, а висока стойност на Ct (36–40 Ct) представляват 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%, Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%,高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3,2% Както е показано на Фигура 1, най-ниският процент на Ct стойност (< 20 Ct) на теста Abbott SARS-CoV-2 (комбинация от RdRp и N ген) е 87,6%, стойността на Ct на гена ORF1a/b на теста Sansure Biotech 2019-nCoV показва нисък Ct值(< 20 Ct) 的 процентът е 50,3%, Процентът 高Ct 值(36–40 Ct) 的 е 3,2%. Както е показано на фигура 1, анализът на Abbott SARS-CoV-2 (съставящ гени RdRp и N) има само ниско процентно значение Ct (< 20 Ct) в размер на 87,6%, значение на Ct гена ORF1a/b в изследванията Sansure Biotech 2019 - Анализът на nCoV показа нисък Ct. Както е показано на фигура 1, анализът на Abbott SARS-CoV-2 (комбиниращ гените RdRp и N) има най-ниската процентна стойност на Ct (< 20 Ct) при 87,6%, докато стойността на Ct на гена ORF1a/b в Sansure Проучване на Biotech 2019 – Анализът на nCoV показа нисък Ct. Процентът на стойностите (< 20 Ct) възлиза на 50,3%, а процентът на високите стойности на Ct (36–40 Ct) възлиза на 3,2%. Процентът на стойностите (< 20 Ct) е 50,3%, а процентът на високите стойности на Ct (36–40 Ct) е 3,2%.Тестът Abbott SARS-CoV-2 B регистрира стойности на Ct над 30. От друга страна, при анализа на BGI SARS-CoV-2 генът ORF1a/b има висока стойност на Ct (> 36 Ct), процентът е 4% (фиг. 1). От друга страна, при анализа на BGI SARS-CoV-2 генът ORF1a/b има висока стойност на Ct (> 36 Ct), процентът е 4% (фиг. 1). От друга страна, в анализа на BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имаше високо значение Ct (> 36 Ct), процентът който съставляваше 4% (рис. 1). От друга страна, при анализа на BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b има висока стойност на Ct (> 36 Ct), чийто процент е 4% (фиг. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%(图1）。 От друга страна, при откриване на BGI SARS-CoV-2, процентът на гена ORF1a/b с висока стойност на Ct (>36 Ct) е 4% (Фигура 1). От друга страна в анализа BGI SARS-CoV-2 процентът на гени ORF1a/b с високи стойности Ct (>36 Ct) възлиза на 4% (рис. 1). От друга страна, в анализа на BGI SARS-CoV-2, процентът на гените ORF1a/b с високи стойности на Ct (>36 Ct) е 4% (фиг. 1).
В това изследване взехме 164 назофарингеални проби. За всички видове анализи, изолирането и амплификацията на РНК се извършват с помощта на методите и комплектите, препоръчани от съответните производители.
Това проучване показа, че тестът на Abbott за SARS-CoV-2 има същата ефективност на откриване като CRS, със 100% положително, отрицателно и цялостно съответствие. Капа споразумението на Коен е 1,00, което показва пълно съгласие с CRS. Подобно проучване на Университета на Вашингтон в САЩ установи, че общата чувствителност и специфичност на теста Abbott за SARS-CoV-2 е съответно 93% и 100% в сравнение с лабораторно определен анализ (LDA) на CDC . 11. Системата за откриване на SARS-CoV-2 на Abbott се основава на едновременното комбинирано откриване на N и RdRp гените, тъй като и двата гена са по-чувствителни, свеждайки до минимум фалшивите отрицателни резултати12. Проучване във Виена, Австрия също показа, че големите обеми на пробите за екстракция и обемите на елуента за откриване минимизират ефектите на разреждане и повишават ефективността на откриване13. По този начин перфектното съвпадение на Abbott за анализа SARS-CoV-2 може да бъде свързано със система за откриване на платформа, която едновременно открива комбинаторни гени, извлича голям брой проби (0,5 ml) и използва голямо количество елуент (40 µl).
Нашите резултати също така показаха, че ефективността на откриване на генетичния тест Daan е почти същата като тази на CRS. Това е в съответствие с проучване14, проведено в университета Анхуей в Хуайнан, Китай, и твърдението на производителя за 100% положително съгласие. Въпреки докладите за постоянни резултати, една проба е фалшиво отрицателна след повторно тестване на същия елуат, но е положителна в анализите Abbott SARS-CoV-2 и Sansure Biotech nCoV-2019. Това предполага, че може да има променливост в резултатите при различните видове анализи. Независимо от това, в проучването, проведено в Китай15, резултатът от анализа на Daan Gene е значително различен (p <0,05) в сравнение с техния лабораторно дефиниран референтен анализ. Независимо от това, в проучването, проведено в Китай15, резултатът от анализа на Daan Gene е значително различен (p <0,05) в сравнение с техния лабораторно дефиниран референтен анализ. Темата не е по-малко, в изследването, проведено в Китай15, резултатът от анализа на Daan Gene се отличава значително (p <0,05) от техния лабораторен еталонен анализ. Въпреки това, в проучване в Китай15, резултатът от анализа на Daan Gene е значително различен (p <0,05) от техния лабораторен референтен анализ.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异＂(p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Въпреки това в изследването, проведено в Китай15, резултатите от генетичния тест Daan значително се отличават (p <0,05) в сравнение с неговия еталонен лабораторен тест. Въпреки това, в проучване в Китай15, резултатите от генетичния тест на Daan са значително различни (p <0,05) в сравнение с референтния лабораторен тест.Това несъответствие може да се дължи на чувствителността на референтния тест за откриване на SARS-CoV-2 и допълнителни изследвания може да са важни за определяне на причината.
В допълнение, нашето проучване оцени сравнителното представяне на SARS-CoV-2 BGI анализа с CRS, показвайки отлично положително процентно съгласие (PPA = 97,9%), отрицателно процентно съгласие (NPA = 100%) и общо процентно съгласие по пол ( OPA). ). = 98,8%). Стойностите на Капа на Коен показват добро съответствие (K = 0,975). Проучванията в Холандия16 и Китай15 показват последователни резултати. Тестът SARS-CoV-2 BGI е тест за откриване на единичен ген (ORF1a/b), използващ 10 µl елуат за амплификация/откриване. Въпреки доброто статистическо съответствие с нашите референтни резултати, анализът пропусна две положителни проби (1,22%) от общата проба. Това може да има огромни клинични последици за динамиката на предаване както на ниво пациент, така и на ниво общност.
Друг сравнителен анализ, включен в това проучване, беше анализът Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); общият процент на съвпадение е 96,3%. Силата на съгласие също се определя от стойността на Капа на Коен, която е 0,925, което показва пълно съгласие с CRS. Отново нашите резултати са идентични с проучванията, проведени в Централния южен университет в Чанша, Китай, и в отдела по клинична лаборатория на народната болница в Лиуджоу, град Лиужоу, Китай17. Въпреки че горното добро статистическо съответствие беше записано, тестът хи-квадрат (тест на MacNemar) показа, че резултатът от анализа на Sansure Biotech има статистически значима разлика в сравнение с CRS (p < 0,005). Въпреки че горното добро статистическо съответствие беше записано, тестът хи-квадрат (тест на MacNemar) показа, че резултатът от анализа на Sansure Biotech има статистически значима разлика в сравнение с CRS (p < 0,005). Независимо от това, че беше установено посоченото по-горе добро статистическо съответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показа, че резултатът от анализа на Sansure Biotech има статистически значима разлика в сравнение с CRS (p < 0,005). Въпреки че беше записано доброто статистическо съответствие по-горе, тестът хи-квадрат (тест на McNemar) показа, че резултатът от анализа на Sansure Biotech има статистически значима разлика в сравнение с CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异 (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。))）) Въпреки отбелязаното по-високо добро статистическо съответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показа статистически значима разлика (p <0,005) между анализите Sansure Biotech и CRS. Въпреки доброто статистическо съответствие, отбелязано по-горе, тестът хи-квадрат (тест на McNemar) показа статистически значима разлика (p <0,005) между анализа на Sansure Biotech и CRS.Установено е, че шест проби (3,66%) са фалшиво отрицателни в сравнение с CRS (допълнителна таблица 1); това е много важно, особено предвид динамиката на предаване на вируса. Горните данни също подкрепят този нисък процент на откриване15.
В това проучване стойностите на Ct бяха определени за всеки анализ и съответната платформа, като най-ниската средна стойност на Ct беше отчетена в анализа на Abbott SARS-CoV-2. Този резултат може да е свързан със системата за едновременно комбинирано генетично тестване на Abbott за откриване на SARS-CoV-2. Следователно, според Фигура 1, 87,6% от резултатите на Abbott SARS-CoV-2 имат стойности на Ct под 20. Само малък брой резултати от пробите (12,4%) са в диапазона 20-30. Ct стойности над 30 не са регистрирани. В допълнение към използването от Abbott на панелния формат за генетично тестване SARS-CoV-2, този резултат може да е свързан с долната граница на откриване (32,5 РНК копия/mL)18, която е три пъти по-ниска от долната граница на компанията от 100 РНК копия /mL. мл) 19.
Това проучване има някои ограничения: първо, ние нямаме стандартни/референтни методи [като вирусен товар или други лабораторни тестове (LDA)] поради липса на ресурси. Второ, всички проби, използвани в това изследване, бяха назофарингеални тампони, докато резултатите не бяха приложими за други типове проби, и трето, размерът на нашата извадка беше малък.
Това проучване сравнява ефективността на четири rRT-PCR анализа за SARS-CoV-2 с помощта на назофарингеални проби. Всички анализи за откриване имаха почти сравнима ефективност, с изключение на анализа Sansure Biotech. Освен това ниският процент на положителност беше идентифициран в анализа Sansure Biotech в сравнение с CRS (p <0,05). Освен това ниският процент на положителност беше идентифициран в анализа Sansure Biotech в сравнение с CRS (p <0,05). Освен това, в теста Sansure Biotech е отбелязан нисък процент положителни резултати в сравнение с CRS (p <0,05). В допълнение, тестът Sansure Biotech показа нисък процент положителни резултати в сравнение с CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05). Освен това анализът на Sansure Biotech има по-ниско ниво на положителни резултати в сравнение с CRS (p <0,05). В допълнение, анализът Sansure Biotech има по-нисък процент на положителност в сравнение с CRS (p <0,05).Анализът Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) на PPA, NPA и общото съгласие надхвърли 93,5% със стойност на силата на съгласие на Cohen Kappa от 0,925. И накрая, Sansure Biotech Assay (RUO) се нуждае от допълнително валидиране за използване в Етиопия и трябва да се обмислят допълнителни изследвания, за да се оценят претенциите от отделни производители.
Дизайнът на сравнително проучване е проведен в четири здравни заведения в Адис Абеба, болница Eka Kotebe, център за лечение на църква Millennium, мемориална болница Zewooditu и специализирана болница за туберкулоза St. Данните са събрани между 1 и 31 декември 2020 г. Лечебните заведения за това проучване са целенасочено избрани въз основа на големия им брой случаи и наличието на големи лечебни центрове в града. По същия начин, инструментите, включително ABI 7500 и Abbott m2000 PCR инструменти в реално време, бяха избрани според препоръките на производителите на NAAT реагенти и четири комплекта за откриване на PCR бяха избрани за това проучване, тъй като повечето лаборатории в Етиопия използваха поне поне четири от тях. Генен тест, Abbott SARS-CoV-2 тест, Sansure Biotech тест и SARS-CoV-2 BGI тест, извършени по време на проучването).
Тестването за SARS-CoV-2 беше извършено от 1 до 30 декември 2020 г. с помощта на 3 ml вирусна транспортна среда (VTM) (Miraclean Technology, Шенжен, Китай) от лица, подложени на разследване за COVID-19, насочени към EPHI. Назофарингеалните проби бяха събрани от обучени събирачи на проби и изпратени до EPHI в тройни опаковки. Преди изолирането на нуклеинова киселина на всяка проба се присвоява уникален идентификационен номер. Екстракцията се извършва от всяка проба веднага след пристигането, като се използват ръчни и автоматични методи за екстракция. По този начин, за автоматичната екстракция на Abbott m2000, 1,3 ml (включително 0,8 ml мъртъв обем и 0,5 ml входящ обем за екстракция) от пробата бяха извлечени от всяка проба и преминаха през Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Иллинойс, САЩ). ) Партида от 96 [92 проби, две контроли за откриване и две контроли без шаблон (NTC)] беше включена в цялостния процес (извличане и откриване) на два кръга на SARS-CoV-2 (EUA) в реално време. добив. По същия начин, за ръчно извличане използвайте същите проби (за автоматично извличане и откриване). По този начин, по време на процеса, 140 µl проби бяха аликвотирани и екстрахирани с помощта на QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Германия) в партиди от 24 (включително 20 проби, две контроли за анализ и две NTC) в продължение на девет кръга. Ръчно екстрахираните елуати бяха амплифицирани и открити с помощта на термичен цикъл ABI 7500, използвайки SARS-CoV-2 BGI анализ, Daan Gene анализ и Sansure Biotech анализ.
Автоматизираното изолиране и пречистване на вирусна РНК на SARS-CoV-2 следва принципа на магнитните перли, като се използват реагенти за подготовка на ДНК проби на Abbott. Инактивирането на пробите и разтварянето на вирусните частици се извършва с помощта на детергент, съдържащ гуанидин изотиоцианат, за денатуриране на протеина и инактивиране на РНКаза. След това РНК се отделя от протеина чрез разделяне на твърда фаза с помощта на силициев диоксид, т.е. гуанидиниевата сол и алкалното рН на лизиращия буфер подпомагат свързването на нуклеиновите киселини със силициевия диоксид (SiO2). Стъпката на изплакване премахва останалите протеини и отломки, за да се получи бистър разтвор. Прозрачната РНК се изолира от микрочастици на основата на силициев диоксид, като се използва магнитното поле на инструмента 20, 21. От друга страна, ръчното изолиране и пречистване на РНК се извършва чрез метода на центрофугиране, вместо магнитна стойка и отделяне на микрочастиците от елуента.
Тестът за откриване на SARS-CoV-2 на Abbott в реално време (Abbott Molecular, Inc.) беше извършен съгласно инструкциите на производителя, който получи EUA19,22 от СЗО и FDA. В този протокол инактивирането на пробата преди екстракция се извършва във водна баня при 56 ° C за 30 минути. След инактивиране на вируса се извършва екстракция на нуклеинова киселина на Abbott m2000 SP инструмент от 0, 5 ml VTM, като се използва Abbott m2000 система за подготовка на ДНК проби. според производителя. Амплификацията и откриването се извършват с помощта на Abbott m2000 RT-PCR инструмент и се извършва двойно откриване за RdRp и N гените. ROX) и VIC P (патентовано багрило) за насочване и откриване на вътрешни контроли, позволяващи едновременно откриване на двата продукта на амплификация 19 .
Методът за откриване на амплификация на този комплект се основава на едноетапна RT-PCR технология. Гените ORF1a/b и N бяха избрани като запазени региони от Daan Gene Technology за откриване на амплификация на целеви региони. Специфични праймери и флуоресцентни сонди (N генни сонди, белязани с FAM, ORF1a/b сонди, белязани с VIC) са проектирани за откриване на SARS-CoV-2 РНК в проби. Крайният елуент и главните смеси се приготвят чрез добавяне на 5 µl елуент към 20 µl от основната смес до краен обем от 25 µl. Амплификацията и откриването се извършват едновременно на ABI 750024 PCR инструмент в реално време.
Гените ORF1a/b и N бяха открити с помощта на комплекта за диагностика на нуклеинови киселини Sansure Biotech nCoV-2019 (флуоресцентно PCR откриване). Подгответе специфични сонди за всеки целеви ген, като изберете FAM канала за ORF1a/b региона и ROX канала за N гена. Към този комплект за анализ се добавят реагентите за елуент и основна смес, както следва: пригответе 30 µl реагент за основна смес и 20 µl елуирана проба за откриване/амплификация. PCR в реално време ABI 750025 беше използван за амплификация/откриване.
Тестът SARS-CoV-2 BGI е флуоресцентен rRT-PCR комплект в реално време за диагностика на COVID-19. Целевият регион се намира в областта ORF1a/b на генома на SARS-CoV-2, което е метод за откриване на единичен ген. В допълнение, човешкият домакински ген β-актин е вътрешно регулиран целеви ген. Основната смес се приготвя чрез смесване на 20 µl от реагента на основната смес и 10 µl от екстрахираната РНК проба в ямкова плака26. За амплификация и откриване беше използван ABI 7500 флуоресцентен количествен PCR инструмент в реално време. Цялата амплификация на нуклеинови киселини, условията на провеждане на PCR за всеки анализ и интерпретацията на резултатите бяха извършени съгласно инструкциите на съответните производители (Таблица 3).
В този сравнителен анализ не използвахме референтния стандартен метод за определяне на процентно съгласие (положително, отрицателно и общо) и други параметри за сравнение за четирите анализа. Всяко тестово сравнение беше направено с CRS, в това проучване CRS беше зададен от правилото „всеки положителен“ и резултатът беше определен, а не чрез единичен тест, ние използвахме поне два съответстващи резултата от теста. Освен това, в случай на предаване на COVID-19, фалшивите отрицателни резултати са по-опасни от фалшивите положителни резултати. Следователно, за да се каже „положителен“ възможно най-точно от резултата от CRS, поне два теста трябва да са положителни, което означава, че поне един положителен резултат е вероятно да дойде от EUA анализ. По този начин, от четири резултата от теста, два или повече резултата от теста, които дават един и същ резултат, се считат за наистина положителни или отрицателни18,27.
Данните бяха събрани с помощта на формуляри за извличане на структурирани данни, въвеждането и анализът на данни бяха извършени с помощта на статистически софтуер Excel и SPSS версия 23.0 за описателна статистика. Положителното, отрицателното и общото процентно съгласие бяха анализирани и беше използван резултат на Капа, за да се определи степента на съгласие на всеки метод с CRS. Капа стойностите се интерпретират, както следва: 0,01 до 0,20 за леко съгласие, 0,21 до 0,40 за общо съгласие, 0,41-0,60 за умерено съгласие, 0,61-0,80 за голямо съгласие и 0,81-0,99 за пълно съгласие28.
Беше получено етично разрешение от Университета на Адис Абеба и всички експериментални протоколи за това проучване бяха одобрени от Съвета за преглед на научната етика на Етиопския институт за обществено здраве. Референтният номер за етичния лиценз на EPHI е EPHI/IRB-279-2020. Всички методи бяха приложени в съответствие с препоръките и разпоредбите на Етиопските национални изчерпателни насоки за лечение на COVID-19. Освен това е получено писмено информирано съгласие от всички участници в проучването преди участие в проучването.
Всички данни, получени или анализирани в това проучване, са включени в тази публикувана статия. Данните в подкрепа на резултатите от това проучване са достъпни от съответния автор при разумно искане.
Световна здравна организация. Препоръки за стратегии за лабораторни тестове за COVID-19: Временни насоки, 21 март 2020 г. № WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (СЗО, 2020 г.).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Интелигентна диагностика на COVID-19 в спешното отделение: All-in на практика. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Интелигентна диагностика на COVID-19 в спешното отделение: All-in на практика.Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интелигентна диагностика на COVID-19 в спешното отделение: всичко на практика.Мулиу Д.С., Пантазопулос И. и Гургулянис К.И. Интелигентна диагностика на COVID-19 в спешните отделения: интеграция от край до край на практика. Експерт Reverend Respire. лекарство. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Оценка на COVID19 ID NOW EUA анализ. Mitchell, SL & St George, K. Оценка на COVID19 ID NOW EUA анализ.Mitchell, SL и St. George, K. Оценка на COVID19 ID NOW EUA анализ.Mitchell SL и St. George K. Оценка на COVID19 ID NOW EUA анализ. J. Клинична. Вирус. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
СЗО. Лабораторно откриване на коронавирусна болест 2019 (COVID-19) при съмнение за заболяване при хора. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (достъп на 15 август 2020 г.) (СЗО, 2020 г.).
Udugama, B. et al. Диагностика на COVID-19: Болести и инструменти за изследване. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Създаване на Колежа на патолозите на Източна, Централна и Южна Африка – Регионално училище по патология на Близкия изток и Южна Африка. Африка. J. Lab. лекарство. 9(1), 1-8 (2020).
Етиопски институт по обществено здраве, Федерално министерство на здравеопазването. Временна национална стратегия и насоки за лабораторна диагностика на COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (достъп на 12 август 2020 г.) (EPHI, 2020 г.).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Фалшиви отрицателни тестове за предизвикателства и последици от инфекцията SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Фалшиви отрицателни тестове за предизвикателства и последици от инфекцията SARS-CoV-2.Волошин С., Пател Н. и Кеселхайм А. С. Фалшиво отрицателни тестове за инфекции на SARS-CoV-2 и техните последствия.Волошин С., Пател Н. и Кеселхайм А. С. Фалшиво-отрицателни тестове за провокация и въздействие на SARS-CoV-2 инфекция. Н. инж. J. Медицина. 383 (6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Фалшиво положителни и фалшиво отрицателни случаи на COVID-19: Респираторна превенция и стратегии за управление, ваксинация и допълнителни перспективи. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Фалшиво положителни и фалшиво отрицателни случаи на COVID-19: Респираторна превенция и стратегии за управление, ваксинация и допълнителни перспективи. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположителни и лошоотрицателни случаи на COVID-19: респираторна профилактика и стратегии за лечение, ваксинация и по-нататъшни перспективи. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Фалшиви положителни и фалшиво отрицателни случаи на COVID-19: респираторна превенция и стратегии за лечение, ваксинация и пътят напред.Мулиу, Д. С. и Гургулианис, К. И. Фалшиво положителни и фалшиво отрицателни случаи на COVID-19: стратегии за респираторна профилактика и лечение, ваксинация и пътят напред. Експерт Reverend Respire. лекарство. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 диагноза в спешното отделение: Виждайки дървото, но губейки гората. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 диагноза в спешното отделение: Виждайки дървото, но губейки гората.Mouliou, DS, Ioannis, P. и Konstantinos, G. COVID-19 Диагноза в спешното отделение: Вижте дървото, изгубете гората.Muliou DS, Ioannis P. и Konstantinos G. COVID-19 Диагноза в спешните отделения: Няма достатъчно гора за дърветата. Появи се. лекарство. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Валидиране и валидиране на аналитичните и клинични резултати на Abbott RealTime SARS-CoV-2 Assay. J. Клинична. Вирус. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на пет комплекта праймери от различен геномен регион на COVID-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на пет комплекта праймери от различни области на генома на COVID-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. и Aflatunyan, B. Сравнение на пет комплекта праймери от различни региони на генома на COVID-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Сравнение на 5 различни генетични региона на COVID-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. и Aflatunyan B. Сравнение на пет комплекта праймери от различни региони на генома на COVID-19 за откриване на вирусна инфекция чрез конвенционална RT-PCR.Иран. J. Микробиология. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Предварителни резултати от националната програма за външна оценка на качеството за откриване на геномни последователности на SARS-CoV-2. J. Клинична. Вирус. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Аналитична оценка на ефикасността на пет комплекта RT-PCR за тежък остър респираторен синдром Коронавирус 2. J. Clinical. лаборатория. ануса. 35 (1), e23643 (2021).
Wang B. и др. Оценка на седем налични в търговската мрежа комплекта за откриване на РНК на SARS-CoV-2 в Китай въз основа на полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време. клинични. химически. лаборатория. лекарство. 58 (9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Сравнение на седем търговски RT-PCR диагностични комплекта за COVID-19. J. Клинична. Вирус. 128, 104412 (2020).
Лу, Ю и др. Сравнение на диагностичната ефективност на два PCR комплекта за откриване на нуклеинови киселини на SARS-CoV-2. J. Клинична. лаборатория. ануса. 34 (10), e23554 (2020).
Lefart, PR и др. Сравнително проучване на четири платформи за тестване на амплификация на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 (NAAT) показа, че производителността на ID NOW е значително влошена в зависимост от пациента и типа на пробата. диагноза. микробиология. заразявам. дис. 99(1), 115200 (2021).
Молекула на Abbott. Добавка към пакета за анализ на SARS-CoV-2 на Abbott в реално време. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Към 10 август 2020 г.) (2020 г.).
Klein, S. et al. Изолиране на SARS-CoV-2 РНК с помощта на магнитни перли за бързо откриване в голям мащаб чрез RT-qPCR и RT-LAMP. Вирус 12(8), 863 (2020).