Интерфериращи фактори в PCR реакциите

По време на PCR реакцията често се срещат някои интерфериращи фактори.
Поради много високата чувствителност на PCR, замърсяването се счита за един от най-важните фактори, влияещи върху резултатите от PCR, и може да доведе до фалшиво положителни резултати.
Също толкова важни са различните източници, които водят до фалшиво отрицателни резултати. Ако една или повече основни части от PCR сместа или самата реакция на амплификация са инхибирани или повлияни, диагностичният анализ може да бъде затруднен. Това може да доведе до намалена ефективност и дори до фалшиво отрицателни резултати.
В допълнение към инхибирането, загуба на целостта на целевата нуклеинова киселина може да възникне поради условията на транспортиране и/или съхранение преди подготовката на пробата. По-специално, високите температури или неадекватното съхранение могат да доведат до увреждане на клетките и нуклеиновите киселини. Фиксирането на клетки и тъкани и вграждането в парафин са добре известни причини за фрагментация на ДНК и постоянен проблем (вижте Фигури 1 и 2). В тези случаи дори оптималната изолация и пречистване няма да помогнат.

Фигура 1 | Ефект на имобилизацията върху целостта на ДНК
Електрофорезата в агарозен гел показа, че качеството на ДНК, изолирана от парафинови срези на аутопсии, варира значително. В екстрактите присъства ДНК с различна средна дължина на фрагментите в зависимост от метода на фиксиране. ДНК се запазва само когато е фиксирана в нативни замразени проби и в буфериран неутрален формалин. Използването на силно киселинен фиксатор на Буен или небуфериран формалин, съдържащ мравчена киселина, води до значителна загуба на ДНК. Останалата фракция е силно фрагментирана.
Отляво дължината на фрагментите е изразена в килобазови двойки (kbp)

Фигура 2 | Загуба на целостта на нуклеиново-киселинните мишени
(a) Пропаст от 3′-5′ и в двете вериги ще доведе до прекъсване на целевата ДНК. Синтезът на ДНК все още ще се случи върху малкия фрагмент. Ако обаче липсва място за свързване на праймери върху ДНК фрагмента, се получава само линейна амплификация. В най-благоприятния случай фрагментите могат да се пренаситет взаимно, но добивите ще бъдат малки и под нивата на откриване.
(б) Загубата на бази, главно поради депуринация и образуване на тимидинов димер, води до намаляване на броя на водородните връзки и намаляване на Tm. По време на удължената фаза на затопляне, праймерите ще се стопят от матричната ДНК и няма да се отгряват дори при по-малко строги условия.
(в) Съседните тиминови бази образуват ТТ димер.
Друг често срещан проблем, който често се среща в молекулярната диагностика, е по-неоптималното освобождаване на целевите нуклеинови киселини в сравнение с фенол-хлороформната екстракция. В екстремни случаи това може да бъде свързано с фалшиво отрицателни резултати. Много време може да се спести чрез лизиране чрез кипене или ензимно разграждане на клетъчни остатъци, но този метод често води до ниска чувствителност на PCR поради недостатъчно освобождаване на нуклеинова киселина.

Инхибиране на полимеразната активност по време на амплификацията

Като цяло, инхибирането се използва като контейнерна концепция, за да се опишат всички фактори, които водят до неоптимални PCR резултати. В строго биохимичен смисъл, инхибирането е ограничено до активността на ензима, т.е. то намалява или предотвратява превръщането на субстрат-продукт чрез взаимодействие с активния център на ДНК полимеразата или нейния кофактор (напр. Mg2+ за Taq ДНК полимераза).
Компонентите в пробата или различни буфери и екстракти, съдържащи реагенти, могат директно да инхибират ензима или да улавят неговите кофактори (напр. EDTA), като по този начин инактивират полимеразата и от своя страна водят до намалени или фалшиво отрицателни PCR резултати.
Въпреки това, много взаимодействия между реакционните компоненти и нуклеинови киселини, съдържащи мишени, също се определят като „PCR инхибитори“. След като целостта на клетката бъде нарушена чрез изолиране и нуклеиновата киселина бъде освободена, могат да възникнат взаимодействия между пробата и заобикалящия я разтвор и твърда фаза. Например, „поглъщателите“ могат да се свързват с едноверижна или двуверижна ДНК чрез нековалентни взаимодействия и да пречат на изолирането и пречистването, като намаляват броя на мишените, които евентуално достигат до PCR реакционния съд.
Като цяло, PCR инхибиторите присъстват в повечето телесни течности и реактиви, използвани за клинични диагностични тестове (урея в урината, хемоглобин и хепарин в кръвта), хранителни добавки (органични компоненти, гликоген, мазнини, Ca2+ йони) и компоненти в околната среда (феноли, тежки метали).

По-разпространени PCR инхибитори могат да бъдат открити в бактерии и еукариотни клетки, нецелева ДНК, ДНК-свързващи макромолекули на тъканни матрици и лабораторно оборудване като ръкавици и пластмаси. Пречистването на нуклеинови киселини по време или след екстракция е предпочитаният метод за отстраняване на PCR инхибитори.
Днес различно автоматизирано оборудване за екстракция може да замени много ръчни протоколи, но 100% възстановяване и/или пречистване на мишени никога не е било постигнато. Потенциални инхибитори може все още да присъстват в пречистените нуклеинови киселини или вече да са подействали. Съществуват различни стратегии за намаляване на въздействието на инхибиторите. Изборът на подходяща полимераза може да окаже значително влияние върху активността на инхибитора. Други доказани методи за намаляване на PCR инхибирането са увеличаване на концентрацията на полимераза или прилагане на добавки като BSA.
Инхибирането на PCR реакциите може да се демонстрира чрез използване на вътрешен контрол на качеството на процеса (IPC).
Трябва да се внимава всички реагенти и други разтвори в комплекта за екстракция, като етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, да се отстранят от изолата на нуклеиновата киселина чрез щателно промиване. В зависимост от концентрацията им, те могат да активират или инхибират PCR.