Интерференционни фактори при PCR реакции

По време на PCR реакцията често се срещат някои смущаващи фактори.
Поради много високата чувствителност на PCR, замърсяването се счита за един от най-важните фактори, влияещи върху резултатите от PCR и може да доведе до фалшиво положителни резултати.
Също толкова критични са различните източници, които водят до фалшиво-отрицателни резултати. Ако една или повече основни части от PCR сместа или самата реакция на амплификация са инхибирани или повлияни, диагностичният анализ може да бъде възпрепятстван. Това може да доведе до намалена ефективност и дори до фалшиво отрицателни резултати.
В допълнение към инхибирането може да настъпи загуба на целостта на целевата нуклеинова киселина поради транспортиране и/или условия на съхранение преди подготовката на пробата. По-специално високите температури или неадекватното съхранение могат да доведат до увреждане на клетките и нуклеиновите киселини. Фиксирането на клетки и тъкани и вграждането в парафин са добре известни причини за фрагментация на ДНК и постоянен проблем (вижте фигури 1 и 2). В тези случаи дори оптималното изолиране и пречистване няма да помогне.

Фигура 1 | Ефект на обездвижването върху целостта на ДНК
Електрофорезата в агарозен гел показва, че качеството на ДНК, изолирана от парафинови срезове на аутопсии, варира значително. ДНК с различна средна дължина на фрагмента присъства в екстрактите в зависимост от метода на фиксиране. ДНК се запазва само когато се фиксира в естествени замразени проби и в буфериран неутрален формалин. Използването на силно кисел фиксатор на Bouin или небуфериран формалин, съдържащ мравчена киселина, доведе до значителна загуба на ДНК. Останалата част е силно фрагментирана.
Отляво дължината на фрагментите е изразена в двойки килобази (kbp)

Фигура 2 | Загуба на целостта на нуклеиновите киселини
(a) 3'-5' празнина на двете вериги ще доведе до прекъсване в целевата ДНК. синтезът на ДНК все още ще се извършва върху малкия фрагмент. Въпреки това, ако място за отгряване на праймера липсва на ДНК фрагмента, настъпва само линейна амплификация. В най-благоприятния случай фрагментите могат да се наситят един друг, но добивите ще бъдат малки и под нивата на откриване.
(b) Загубата на бази, главно поради депуринация и образуване на тимидинов димер, води до намаляване на броя на Н-връзките и намаляване на Tm. По време на удължената фаза на затопляне, праймерите ще се стопят от матричната ДНК и няма да се закалят дори при по-малко строги условия.
(c) Съседни тиминови бази образуват ТТ димер.
Друг често срещан проблем, който често възниква в молекулярната диагностика, е по-малко от оптималното освобождаване на целеви нуклеинови киселини в сравнение с екстракцията с фенол-хлороформ. В екстремни случаи това може да бъде свързано с фалшиви отрицания. Много време може да се спести чрез кипене на лизис или ензимно смилане на клетъчни остатъци, но този метод често води до ниска PCR чувствителност поради недостатъчно освобождаване на нуклеинова киселина.

Инхибиране на полимеразната активност по време на амплификация

Като цяло, инхибирането се използва като контейнерна концепция за описание на всички фактори, които водят до неоптимални резултати от PCR. В строго биохимичен смисъл, инхибирането е ограничено до активността на ензима, т.е. то намалява или предотвратява превръщането на субстрат-продукт чрез взаимодействие с активното място на ДНК полимеразата или неин кофактор (напр. Mg2+ за Taq ДНК полимераза).
Компонентите в пробата или различни буфери и екстракти, съдържащи реагенти, могат директно да инхибират ензима или да уловят неговите кофактори (напр. EDTA), като по този начин инактивират полимеразата и на свой ред водят до намалени или фалшиво отрицателни PCR резултати.
Въпреки това, много взаимодействия между компонентите на реакцията и нуклеинови киселини, съдържащи мишена, също се означават като „PCR инхибитори“. След като целостта на клетката бъде нарушена от изолирането и нуклеиновата киселина се освободи, могат да възникнат взаимодействия между пробата и заобикалящия я разтвор и твърда фаза. Например, „чистачите“ могат да свържат едно- или двуверижна ДНК чрез нековалентни взаимодействия и да пречат на изолирането и пречистването чрез намаляване на броя на мишените, които в крайна сметка достигат до PCR реакционния съд.
Като цяло PCR инхибиторите присъстват в повечето телесни течности и реагенти, използвани за клинични диагностични тестове (урея в урина, хемоглобин и хепарин в кръв), хранителни добавки (органични компоненти, гликоген, мазнини, Ca2+ йони) и компоненти в околната среда (феноли , тежки метали)

По-често срещаните PCR инхибитори могат да бъдат намерени в бактерии и еукариотни клетки, нецелева ДНК, ДНК-свързващи макромолекули на тъканни матрици и лабораторно оборудване като ръкавици и пластмаси. Пречистването на нуклеинови киселини по време или след екстракцията е предпочитаният метод за отстраняване на PCR инхибитори.
Днес различни автоматизирани съоръжения за екстракция могат да заменят много ръчни протоколи, но 100% възстановяване и/или пречистване на мишените никога не е било постигнато. Потенциалните инхибитори може все още да присъстват в пречистените нуклеинови киселини или може вече да са подействали. Съществуват различни стратегии за намаляване на въздействието на инхибиторите. Изборът на подходяща полимераза може да има значително влияние върху инхибиторната активност. Други доказани методи за намаляване на PCR инхибирането са увеличаване на концентрацията на полимераза или прилагане на добавки като BSA.
Инхибирането на PCR реакциите може да се демонстрира чрез използване на вътрешен контрол на качеството на процеса (IPC).
Трябва да се внимава да се отстранят всички реагенти и други разтвори в комплекта за екстракция, като етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, от изолата на нуклеиновата киселина чрез щателна стъпка на измиване. В зависимост от тяхната концентрация, те могат да активират или инхибират PCR.