Интерферентни фактори в PCR реакциите

По време на PCR реакцията често се срещат някои интерфериращи фактори.
Поради много високата чувствителност на PCR, замърсяването се счита за един от най -важните фактори, влияещи върху резултатите от PCR и може да доведе до фалшиви положителни резултати.
Също толкова критични са различните източници, които водят до фалшиво отрицателни резултати. Ако една или повече съществени части от PCR сместа или самата реакция на амплификация са инхибирани или пречат, диагностичният анализ може да бъде възпрепятстван. Това може да доведе до намалена ефективност и дори фалшиви отрицателни резултати.
В допълнение към инхибирането, може да настъпи загуба на целостта на целевата нуклеинова киселина поради условията на доставка и/или съхранение преди подготовката на пробата. По -специално, високите температури или неадекватното съхранение могат да доведат до увреждане на клетките и нуклеиновите киселини. Фиксирането на клетките и тъканите и вграждането на парафин са добре известни причини за фрагментация на ДНК и постоянен проблем (виж фигури 1 и 2). В тези случаи дори оптималната изолация и пречистване няма да помогне.

Фигура 1 | Ефект на обездвижването върху целостта на ДНК
Електрофорезата на агарозен гел показа, че качеството на ДНК, изолирана от парафинови участъци от аутопсии, варира значително. ДНК с различна средна дължина на фрагмента присъства в екстрактите в зависимост от метода на фиксиране. ДНК се запазва само когато се фиксира в естествени замразени проби и в буфериран неутрален формалин. Използването на силно киселинно фиксиране на буините или не-не-некофириран формал, съдържащ мравки киселини, доведе до значителна загуба на ДНК. Останалата фракция е силно фрагментирана.
Вляво дължината на фрагментите се изразява в килобазни двойки (KBP)

Фигура 2 | Загуба на цялост на целите на нуклеиновата киселина
(A) 3'-5 'празнина на двете нишки ще доведе до прекъсване на целевата ДНК. Синтезът на ДНК все още ще се появи на малкия фрагмент. Ако обаче в ДНК фрагмента липсва сайт за отгряване на праймер, възниква само линейна амплификация. В най -благоприятния случай фрагментите могат да се редуцират взаимно, но добивите ще бъдат малки и под нивата на откриване.
(б) Загубата на основи, главно поради депуринация и образуване на димер на тимидин, води до намаляване на броя на Н-връзките и намаляване на ТМ. По време на удължената фаза на затопляне праймерите ще се стопят от матричната ДНК и няма да отгряват дори при по -малко строги условия.
в) Съседни бази на тимин образуват TT димер.
Друг често срещан проблем, който често възниква при молекулярната диагностика, е по-малко от оптималното освобождаване на целевите нуклеинови киселини в сравнение с екстракцията на фенол-хлороформ. В крайни случаи това може да бъде свързано с фалшиви негативи. Много време може да бъде запазено чрез кипене на лизис или ензимно храносмилане на клетъчните отломки, но този метод често води до ниска чувствителност към PCR поради недостатъчно освобождаване на нуклеинова киселина.

Инхибиране на полимеразната активност по време на амплификация

По принцип инхибирането се използва като концепция за контейнери за описване на всички фактори, които водят до неоптимални резултати от PCR. В строго биохимичен смисъл инхибирането е ограничено до активността на ензима, т.е. намалява или предотвратява превръщането на субстратния продукт чрез взаимодействие с активното място на ДНК полимеразата или неговия кофактор (напр. Mg2+ за TAQ ДНК полимераза).
Компонентите в пробата или различни буфери и екстракти, съдържащи реагенти, могат директно да инхибират ензима или да улавят неговите кофактори (напр. EDTA), като по този начин инактивират полимеразата и от своя страна водят до намалени или фалшиви отрицателни PCR резултати.
Въпреки това, много взаимодействия между реакционните компоненти и съдържащите целеви нуклеинови киселини също са обозначени като „PCR инхибитори“. След като целостта на клетката бъде прекъсната от изолация и се отделя нуклеиновата киселина, могат да възникнат взаимодействия между пробата и заобикалящия му разтвор и твърдата фаза. Например, „чистачите“ могат да свързват едно- или двуверижна ДНК чрез нековалентни взаимодействия и да пречат на изолацията и пречистването чрез намаляване на броя на целите, които в крайна сметка достигат PCR реакционния съд.
Като цяло, PCR инхибиторите присъстват в повечето телесни течности и реагенти, използвани за клинични диагностични тестове (урея в урина, хемоглобин и хепарин в кръвта), хранителни добавки (органични компоненти, гликоген, мазнини, Са2+ йони) и компоненти в околната среда (феноли (феноли (феноли (феноли , тежки метали)

По-разпространени PCR инхибитори могат да бъдат открити в бактерии и еукариотни клетки, нецелеви ДНК, ДНК-свързващи макромолекули на тъканните матрици и лабораторно оборудване като ръкавици и пластмаси. Пречистването на нуклеиновите киселини по време или след екстракция е предпочитаният метод за отстраняване на PCR инхибитори.
Днес различно автоматизирано оборудване за извличане може да замени много ръчни протоколи, но 100% възстановяване и/или пречистване на целите никога не е постигнато. Потенциалните инхибитори все още могат да присъстват в пречистените нуклеинови киселини или вече могат да влязат в сила. Съществуват различни стратегии за намаляване на въздействието на инхибиторите. Изборът на подходяща полимераза може да окаже значително влияние върху активността на инхибиторите. Други доказани методи за намаляване на инхибирането на PCR са увеличаване на концентрацията на полимераза или прилагане на добавки като BSA.
Инхибирането на PCR реакции може да бъде демонстрирано чрез използването на вътрешен контрол на качеството на процеса (IPC).
Трябва да се внимава да се отстранят всички реагенти и други разтвори в комплекта за екстракция, като етанол, EDTA, Cetab, LiCl, GUSCN, SDS, изопропанол и фенол, от изолацията на нуклеиновата киселина чрез задълбочен етап на измиване. В зависимост от тяхната концентрация, те могат да активират или инхибират PCR.