Тестване за ДНК метилиране, комбинирано със смартфони, за ранен скрининг на тумори и скрининг на левкемия с точност от 90,0%!

Ранното откриване на рак, базирано на течна биопсия, е ново направление в откриването и диагностиката на рак, предложено от Националния институт по рака на САЩ през последните години, с цел откриване на ранен рак или дори предракови лезии. То се използва широко като нов биомаркер за ранна диагностика на различни злокачествени заболявания, включително рак на белия дроб, стомашно-чревни тумори, глиоми и гинекологични тумори.

Появата на платформи за идентифициране на биомаркери на метилационния ландшафт (Methylscape) има потенциал значително да подобри съществуващия ранен скрининг за рак, поставяйки пациентите в най-ранния лечим стадий.

Наскоро изследователи разработиха проста и директна сензорна платформа за откриване на метилационен ландшафт, базирана на златни наночастици, декорирани с цистеамин (Cyst/AuNPs), комбинирани с биосензор, базиран на смартфон, който позволява бърз ранен скрининг на широк спектър от тумори. Ранният скрининг за левкемия може да се извърши в рамките на 15 минути след екстракция на ДНК от кръвна проба, с точност от 90,0%. Заглавие на статията: Бързо откриване на ракова ДНК в човешка кръв с помощта на AuNPs, покрити с цистеамин, и смартфон с възможност за машинно обучение.

Фигура 1. Една проста и бърза платформа за наблюдение за скрининг на рак чрез компоненти Cyst/AuNPs може да бъде осъществена в две прости стъпки.

Това е показано на Фигура 1. Първо, воден разтвор е използван за разтваряне на ДНК фрагментите. След това към смесения разтвор са добавени Cyst/AuNPs. Нормалната и злокачествената ДНК имат различни свойства на метилиране, което води до ДНК фрагменти с различни модели на самосглобяване. Нормалната ДНК агрегира свободно и в крайна сметка агрегира Cyst/AuNPs, което води до червено-изместен характер на Cyst/AuNPs, така че промяна в цвета от червено към лилаво може да се наблюдава с невъоръжено око. За разлика от това, уникалният профил на метилиране на раковата ДНК води до производството на по-големи клъстери от ДНК фрагменти.

Изображения на 96-ямкови плаки са направени с помощта на камера на смартфон. Раковата ДНК е измерена със смартфон, оборудван с машинно обучение, в сравнение с методи, базирани на спектроскопия.

Скрининг за рак в реални кръвни проби

За да разширят полезността на сензорната платформа, изследователите приложили сензор, който успешно разграничава нормална от ракова ДНК в реални кръвни проби. Моделите на метилиране в CpG сайтовете епигенетично регулират генната експресия. При почти всички видове рак са наблюдавани редуващи се промени в ДНК метилирането и по този начин в експресията на гени, които насърчават туморогенезата.

Като модел за други видове рак, свързани с ДНК метилиране, изследователите са използвали кръвни проби от пациенти с левкемия и здрави контроли, за да изследват ефективността на метилационния ландшафт при диференциране на левкемични ракови заболявания. Този биомаркер на метилационния ландшафт не само превъзхожда съществуващите методи за бърз скрининг на левкемия, но и демонстрира осъществимостта на разширяването му до ранно откриване на широк спектър от ракови заболявания, използвайки този прост и лесен анализ.

Анализирана е ДНК от кръвни проби от 31 пациенти с левкемия и 12 здрави индивида. Както е показано на диаграмата на Фигура 2а, относителната абсорбция на раковите проби (ΔA650/525) е по-ниска от тази на ДНК от нормални проби. Това се дължи главно на повишената хидрофобност, водеща до плътна агрегация на раковата ДНК, което предотвратява агрегацията на Cyst/AuNPs. В резултат на това тези наночастици са напълно диспергирани във външните слоеве на раковите агрегати, което води до различна дисперсия на Cyst/AuNPs, адсорбирани върху нормални и ракови ДНК агрегати. ROC кривите са генерирани чрез промяна на прага от минимална стойност ΔA650/525 до максимална стойност.

Фигура 2.(a) Относителни стойности на абсорбция на разтвори на цисти/AuNPs, показващи наличието на нормална (синя) и ракова (червена) ДНК при оптимизирани условия

(DA650/525) на кутийкови диаграми; (б) ROC анализ и оценка на диагностични тестове. (в) Матрица на объркване за диагностициране на нормални и онкологични пациенти. (г) Чувствителност, специфичност, положителна прогностична стойност (PPV), отрицателна прогностична стойност (NPV) и точност на разработения метод.

Както е показано на Фигура 2b, площта под ROC кривата (AUC = 0.9274), получена за разработения сензор, показва висока чувствителност и специфичност. Както може да се види от квадратчето, най-ниската точка, представляваща нормалната ДНК група, не е добре отделена от най-високата точка, представляваща раковата ДНК група; следователно, за да се разграничат нормалните и раковите групи, е използвана логистична регресия. Като се има предвид набор от независими променливи, тя оценява вероятността за настъпване на събитие, като например ракова или нормална група. Зависимата променлива варира между 0 и 1. Следователно резултатът е вероятност. Определихме вероятността за идентифициране на рак (P) въз основа на ΔA650/525, както следва.

където b=5.3533,w1=-6.965. За класификация на проби, вероятност по-малка от 0.5 показва нормална проба, докато вероятност от 0.5 или по-висока показва ракова проба. Фигура 2в изобразява матрицата на объркване, генерирана от кръстосаната валидация „leave-it-alone“, която е използвана за валидиране на стабилността на метода за класификация. Фигура 2d обобщава оценката на диагностичния тест на метода, включително чувствителност, специфичност, положителна прогностична стойност (PPV) и отрицателна прогностична стойност (NPV).

Биосензори, базирани на смартфони

За да опростят допълнително тестването на пробите без използването на спектрофотометри, изследователите използваха изкуствен интелект (ИИ), за да интерпретират цвета на разтвора и да разграничат нормални от ракови индивиди. Предвид това, компютърното зрение беше използвано за преобразуване на цвета на разтвора Cyst/AuNPs в нормална ДНК (лилаво) или ракова ДНК (червено), използвайки изображения на 96-ямкови плаки, направени с камера на мобилен телефон. Изкуственият интелект може да намали разходите и да подобри достъпността при интерпретиране на цвета на разтвори от наночастици, и то без използването на каквито и да е оптични хардуерни аксесоари за смартфони. Накрая, два модела за машинно обучение, включително Random Forest (RF) и Support Vector Machine (SVM), бяха обучени да конструират моделите. Както RF, така и SVM модела правилно класифицираха пробите като положителни и отрицателни с точност от 90,0%. Това предполага, че използването на изкуствен интелект в биосензори, базирани на мобилни телефони, е напълно възможно.

Фигура 3.(a) Целеви клас на разтвора, записан по време на подготовката на пробата за стъпката на заснемане на изображението. (b) Примерно изображение, заснето по време на стъпката на заснемане на изображението. (c) Интензитет на цвета на разтвора циста/AuNPs във всяка ямка на 96-ямковата плака, извлечена от изображението (b).

Използвайки Cyst/AuNPs, изследователи успешно разработиха проста сензорна платформа за откриване на метилационен ландшафт и сензор, способен да разграничава нормална ДНК от ракова ДНК при използване на реални кръвни проби за скрининг на левкемия. Разработеният сензор демонстрира, че ДНК, извлечена от реални кръвни проби, е способна бързо и рентабилно да открие малки количества ракова ДНК (3nM) при пациенти с левкемия за 15 минути и показва точност от 95,3%. За да се опрости допълнително тестването на пробите чрез елиминиране на необходимостта от спектрофотометър, беше използвано машинно обучение за интерпретиране на цвета на разтвора и разграничаване между нормални и ракови индивиди, използвайки снимка от мобилен телефон, като точността също беше постигната от 90,0%.

Референция: DOI: 10.1039/d2ra05725e